送檢貓三聯(lián)抗體（中和試驗(yàn)法）或狂犬抗體（ELISA法）檢測(cè)樣品時(shí)，是否曾因“樣品不合格”而困惑？這不僅延誤檢測(cè)進(jìn)程，更可能影響對(duì)動(dòng)物免疫狀態(tài)的準(zhǔn)確評(píng)估。本文將從科學(xué)角度解析為何必須使用合格血清，幫助您規(guī)避常見問題。
核心原則：抗體檢測(cè)僅接受血清樣品
根據(jù)WOAH（原OIE）《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》和《中國(guó)獸藥典》檢測(cè)要求，無論是檢測(cè)貓三聯(lián)抗體的中和試驗(yàn)，還是檢測(cè)狂犬抗體的ELISA法，檢測(cè)樣品均須使用合格的血清。使用全血或血漿作為樣品，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)無法進(jìn)行或結(jié)果嚴(yán)重失真。
全血 vs 血漿 vs 血清，有何不同？
全血：直接從動(dòng)物血管中采集、未經(jīng)處理的血液稱為全血，包含血細(xì)胞和血漿；
血漿：如果全血中加入抗凝劑（如EDTA、檸檬酸鈉、肝素），后經(jīng)離心去掉血細(xì)胞，得到的淡黃色液體稱為血漿。包含凝血因子、纖維蛋白原、抗凝劑等；
血清：如果讓全血自然凝固，后經(jīng)離心去掉血凝塊，得到的上清液就是血清。
關(guān)鍵差異：血清不含纖維蛋白原和大部分凝血因子，也沒有額外添加的抗凝劑，這正是抗體檢測(cè)所必需的純凈環(huán)境。
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
為什么血漿和全血不可作為抗體檢測(cè)的樣品？
血漿中的抗凝劑對(duì)檢測(cè)的影響
中和試驗(yàn)（貓三聯(lián)）：此實(shí)驗(yàn)的核心在于樣品中的抗體能否“中和”活病毒。血漿中添加的抗凝劑，會(huì)干擾病毒與抗體的特異性結(jié)合，甚至直接影響病毒的活性或細(xì)胞的健康狀態(tài)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)重偏差或無效。
ELISA（狂犬）：ELISA依賴于抗原-抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)。如試劑盒使用辣根過氧化物酶作為標(biāo)記酶，肝素會(huì)有影響檢測(cè)結(jié)果；有研究表明，EDTA 抗凝的血液樣品總體OD值高于血清樣品，對(duì) ELISA 檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生正向干擾；抗凝劑還可能非特異性地結(jié)合到反應(yīng)板上，造成背景干擾。
血漿中纖維蛋白原對(duì)檢測(cè)的影響
血漿中富含纖維蛋白原。在ELISA檢測(cè)過程中，纖維蛋白原很容易聚集成細(xì)小的纖維蛋白凝塊。這些凝塊會(huì)：
堵塞加樣槍頭或加樣孔，導(dǎo)致加樣量不準(zhǔn)。
包裹住抗體，阻止其與板子上的抗原結(jié)合，造成假陰性。
在孔內(nèi)形成不均勻的沉淀，影響最終顯色的均一性和讀數(shù)的準(zhǔn)確性。
全血對(duì)檢測(cè)的影響
1.嚴(yán)重溶血風(fēng)險(xiǎn)：全血在運(yùn)輸、離心過程中，紅細(xì)胞極易破裂（溶血），釋放出血紅蛋白和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。
中和試驗(yàn)：溶血釋放的物質(zhì)具有細(xì)胞毒性，能直接殺死實(shí)驗(yàn)用的敏感細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
ELISA：血紅蛋白有顏色（紅色/棕色），會(huì)嚴(yán)重干擾光學(xué)讀數(shù)（尤其是ELISA常用的450nm波長(zhǎng)），造成假陽性或假陰性。溶血釋放的細(xì)胞內(nèi)酶也可能干擾ELISA的酶促反應(yīng)。
2.含有大量干擾物：除了溶血產(chǎn)物，血細(xì)胞本身含有無數(shù)的酶、脂類等，都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
為什么對(duì)血清量也有要求？
如中和試驗(yàn)要求送檢測(cè)血清樣品量需達(dá)到0.8-1mL，主要原因有以下幾點(diǎn)：
1.實(shí)驗(yàn)需求：無論是中和試驗(yàn)還是ELISA，都需要消耗一定體積的血清來完成檢測(cè)流程，包括必要的重復(fù)孔或稀釋步驟（尤其是中和試驗(yàn)需要做系列稀釋）。
2.質(zhì)控與復(fù)檢需求：實(shí)驗(yàn)室需要進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)控，遇到可疑或臨界結(jié)果時(shí)可能需要復(fù)測(cè)確認(rèn)。樣品量不足，無法完成復(fù)檢。
3.操作損耗：移液過程中，不可避免會(huì)有少量血清粘附在管壁或槍頭上，需預(yù)留損耗量。
如何成功獲取一份合格血清？（避免溶血是核心）
溶血是導(dǎo)致血清樣品不合格的最常見原因，避免溶血要注意以下要點(diǎn)：
1.選擇合適的采血管：務(wù)必使用干燥、潔凈的血清分離管（通常為紅頭）。不可使用含抗凝劑的采血管（如紫頭/EDTA、藍(lán)頭/檸檬酸鈉、綠頭/肝素）。
2.規(guī)范采血操作：使用合適型號(hào)的針頭，確保穿刺順利。抽血時(shí)負(fù)壓適中，避免過度抽吸。采血后，不要?jiǎng)×覔u晃，靜置時(shí)豎直傾斜放置，促進(jìn)血液凝固。
3.確保血液完全凝固：無論是室溫條件下還是低溫條件下，均需靜置等待血液樣品充分凝固后，再進(jìn)行離心操作，確保血液完全凝固。如果未完全凝固就離心，會(huì)形成纖維蛋白絲或凝塊。
4.離心是關(guān)鍵：通常設(shè)置轉(zhuǎn)速3000-4000rpm/min，離心5-10 分鐘，即可獲得較為純凈的血清。轉(zhuǎn)速太低或時(shí)間太短，血細(xì)胞分離不徹底，血清量少且易混入細(xì)胞。
5.小心移取血清：用移液器小心吸取上層的血清轉(zhuǎn)移到標(biāo)記清晰的無菌管中。需避免觸碰到下層的血細(xì)胞層。
6.儲(chǔ)存與運(yùn)輸：分離出的血清應(yīng)盡快檢測(cè)。如需保存或運(yùn)輸，請(qǐng)置于-20°C或更低溫度冷凍（避免反復(fù)凍融！）。運(yùn)輸時(shí)必須確保全程冷凍狀態(tài)。
總結(jié)：樣品不合格，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響！
使用血漿：抗凝劑和纖維蛋白原干擾檢測(cè)，結(jié)果不可信。
使用全血：極易發(fā)生溶血或存在大量干擾物，檢測(cè)根本無法進(jìn)行。
樣品嚴(yán)重溶血：檢測(cè)無法進(jìn)行或結(jié)果無效。
血清量不足：可能無法完成檢測(cè)或復(fù)檢，導(dǎo)致無法出具報(bào)告。
血清未完全分離/污染：將直接影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。
一份合格的血清樣品，是獲得準(zhǔn)確可靠的貓三聯(lián)、狂犬疫苗抗體檢測(cè)結(jié)果的基石！嚴(yán)格遵循“使用血清分離管、規(guī)范采血、確保血液完全凝固、充分離心、足量清亮血清、冷凍保存運(yùn)輸”這六大要點(diǎn)，就能最大程度避免“樣品不合格”。
參考文獻(xiàn)：
[1]. 2023World Organization for Animal Health (WOAH). Chapter 3.1.19. Rabies (infection with Virus and Other Lyssaviruses). In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals.Paris,France.
[2]. 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典: 三部 [S]. 2020年版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2020: 通則3406。
[3]. 全國(guó)體外診斷網(wǎng)CAIVD. 免疫學(xué)檢測(cè)的干擾因素和處理策略專家共識(shí)[Z].全國(guó)體外診斷網(wǎng)CAIVD微信公眾號(hào)。
[4]. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)廢品加工車間. 抗凝劑對(duì)免疫學(xué)方法檢測(cè)的影響及原理解析 [EB/OL].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)廢品加工車間微信公眾號(hào)。
